奥林巴斯CX33显微镜荧光观察颗粒样品

使用奥林巴斯 CX33 显微镜进行荧光观察颗粒样品（如荧光标记的化妆品颗粒、生物微粒等），需结合其硬件特性与荧光成像原理，以下是具体操作流程及注意事项：

一、样品预处理（针对颗粒样品）

分散与富集

若颗粒团聚，超声处理 1-2 分钟（功率≤50W）使其均匀分散；

微米级颗粒：通过 0.45μm 滤膜过滤，将颗粒截留于膜表面，提高观察密度；

纳米颗粒：可选负染色法（2% 磷钨酸）增强对比度，或直接利用表面修饰的荧光基团（如罗丹明 B 标记）。

荧光标记

无荧光颗粒：用对应激发波长的荧光染料染色（如绿色荧光选 FITC，红色选 Cy3）；

标记后需清洗去除游离染料，避免背景干扰。

二、设备配置与参数设置

荧光附件安装

插入紧凑型荧光照明器（需额外配置），LED 光源预对中，无需手动校准；

聚光镜切换至FL（荧光）位置，阻挡透射光，减少背景杂光。

滤光片选择（根据荧光类型）

绿色荧光颗粒（如 FITC、GFP）：蓝光激发（BP470-490nm），发射光 BP510-550nm；

红色荧光颗粒（如罗丹明、Cy3）：绿光激发（BP530-550nm），发射光 BP570-620nm；

若为多色标记，需依次单通道采集，避免串色。

光源与光阑调节

LED 光源强度调至 50%-70%（延长荧光寿命，避免淬灭）；

孔径光阑缩小至 50%-70%（增强对比度，减少散射光）。

三、荧光观察操作步骤

低倍镜定位（4X/10X）

明场下找到颗粒密集区域，记录坐标；

切换荧光通道，观察荧光分布（如脂质体颗粒可能边缘荧光增强）。

高倍镜精细观察（40X/100X 油镜）

100X 油镜需滴加香柏油，微调焦至颗粒边缘清晰（避免压碎玻片，工作距离 0.13mm）；

观察形态（球形 / 片状）、荧光均匀性（如纳米颗粒是否团聚导致荧光聚集）。

动态或三维观察（可选）

若需时间序列成像，开启 LED 低光毒性模式（减少光损伤）；

配合 CellSens 软件进行 Z-stack 扫描，重建颗粒三维分布（需载物台高精度升降）。

四、图像优化与分析

对比度增强

柯勒照明下调节聚光镜高度，确保光斑均匀覆盖视野；

暗场模式辅助观察透明颗粒的荧光散射（需暗场聚光镜附件）。

量化分析

粒径测量：CellSens 或 ImageJ 标尺功能，统计≥100 个颗粒的 D10/D50/D90；

荧光强度：标准化背景后，分析单颗粒或区域平均强度（反映标记效率）；

形态分类：球形度、长宽比等参数，区分团聚与分散状态。

多模态联用

白光 + 荧光叠加成像，定位荧光颗粒的物理位置；

结合偏光模式，分析矿物颗粒的双折射（如二氧化钛的晶型差异）。

五、注意事项

防荧光淬灭：快速拍照，避免长时间激发；可添加抗淬灭剂（如 DABCO）。

载玻片选择：使用薄型盖玻片（0.17mm），避免光路偏差；荧光样品需避光保存。

物镜维护：油镜使用后及时用二甲苯擦拭，防止香柏油残留影响透光率。

环境控制：关闭室内光源，减少杂散光；空调控温（25℃±1℃），避免热漂移。

总结

奥林巴斯 CX33 通过LED 荧光照明 + UIS2 光学系统，可实现颗粒样品的高对比度荧光观察，尤其适合微米级荧光标记颗粒的形态分析与定量研究。结合样品预处理（分散 / 染色）、滤光片精准匹配及软件分析，能有效支撑化妆品、生物医学等领域的颗粒表征需求。

（注：CX33 需选配荧光模块，基础机型仅支持明场 / 暗场，升级后可实现蓝激发荧光观察。）