徕卡DM2500显微镜荧光观察细胞染色

徕卡 DM2500 荧光显微镜细胞染色观察

一、徕卡 DM2500 荧光显微镜核心配置与技术优势

• 光源类型：

• 蓝光通道（BP450-490，适合 FITC、GFP，发射光 515-550nm）；

• 绿光通道（BP510-550，适合 TRITC、Texas Red，发射光 590nm 长通）；

• 紫外通道（BP330-385，适合 DAPI、Hoechst，发射光 420nm 长通）。

• 标配 100W 汞灯（适合 DAPI、FITC、TRITC 等常规荧光染料），可选配 LED 固态光源（寿命长、稳定性高）。

• 滤光片组（Cube）：

• 物镜兼容性：

• 高数值孔径（NA）物镜（如 Plan Apo 40×/0.95，油镜 100×/1.3），减少荧光信号损失。

二、细胞染色样本制备与荧光标记策略

（一）样本固定与透化

1. 固定方法

• 醛类固定：4% 多聚甲醛（室温 10-15min），保持细胞形态，适合膜蛋白标记；

• 甲醇 / 丙酮固定（-20℃，5min），增强膜通透性，适合胞内抗原（如细胞骨架）。

2. 透化处理

• 0.1% Triton X-100/PBS（室温 5min），破坏细胞膜脂质双分子层，便于抗体或染料进入胞内。

（二）荧光染色方案（按靶标分类）

三、DM2500 荧光观察操作流程与参数优化

（一）显微镜启动与光路调节

1. 光源预热与滤光片切换

• 汞灯需预热 10-15min 至稳定，避免频繁开关（影响寿命）；

• 根据染料选择对应滤光片组，通过转盘切换（如观察 DAPI 时插入 UV Cube）。

2. ** Köhler 照明调节 **

• 调节聚光镜光阑（缩小至 1/2 视野），调中聚光镜后扩大光阑，确保光斑均匀覆盖视野。

（二）荧光观察步骤

1. 低倍镜定位与高倍镜切换

• 先用明场（10× 物镜）找到细胞区域，标记后切换至对应荧光通道；

• 切换高倍镜（40×/100×）时，滴加镜油（油镜），缓慢调节细准焦螺旋至图像清晰。

2. 曝光与信号采集

• 调节光源强度（通过 ND 滤光片，10%-50% 即可），避免强激发导致荧光淬灭；

• 相机曝光时间：DAPI 约 50-100ms，FITC 约 100-300ms，根据信号强弱微调（避免过曝产生伪影）。

（三）防淬灭与背景控制

• 封片优化：

• 用含抗淬灭剂的封片剂（如 Vectashield），盖玻片四周用指甲油密封，减少荧光衰减；

• 背景抑制：

• 样本洗涤：PBS 洗 3 次，每次 5min，去除未结合染料；

• 自发荧光排除：用阴性对照（未染色细胞）确定背景荧光水平。

四、荧光图像采集与分析要点

1. 拍摄参数标准化

• 统一放大倍数、曝光时间、增益（Gain），便于组间对比；

• 多通道成像时，采用 “顺序扫描"（先拍短波长再拍长波长），避免串色（如 DAPI 激发光干扰 FITC 信号）。

2. 定量分析指标

• 荧光强度：用 ImageJ 软件测量平均荧光密度（Integrated Density），排除背景值；

• 共定位分析：通过 Pearson 系数（0-1）量化两种荧光信号的重叠程度；

• 细胞计数：结合 DAPI 核染色，自动计数视野内细胞数量（需设置合适阈值）。

3. 动态观察（活细胞）

• 配置加热台（37℃）和 CO₂培养箱，维持细胞活性；

• 采用间隔拍摄（如每 5min 一次），记录荧光蛋白（如 GFP）的动态分布。

五、常见问题与解决方案

六、延伸技术：DM2500 荧光显微镜的进阶应用

• FISH（荧光原位杂交）：

• 用于基因定位（如染色体荧光标记），需搭配紫外通道观察探针信号；

• 免疫荧光共染色：

• 结合两种以上抗体（如 α-tubulin-FITC + γ-H2AX-TRITC），研究 DNA 损伤与微管关系；

• 光漂白恢复（FRAP）：

• 通过高强度激光漂白局部荧光，利用 DM2500 的高灵敏度相机记录荧光恢复速率，分析蛋白流动性。

七、安全操作与设备维护

• 光源防护：

• 汞灯开启时避免直视光源，佩戴紫外防护眼镜；

• 染料安全：

• 荧光染料（如 DAPI、PI）具潜在毒性，操作时戴手套，废弃物按生物危害处理；

• 日常维护：

• 每周用无尘布清洁载物台和物镜，每月检查滤光片组是否有灰尘（影响光透过率）。