奥林巴斯正置荧光显微镜CX33观察植物细胞

使用奥林巴斯正置荧光显微镜 CX33 观察植物细胞时，需结合植物细胞的结构特点（如细胞壁、叶绿体等）和荧光标记需求，从样品制备到显微镜操作进行系统性规划。以下是详细步骤及注意事项：

一、样品制备与荧光标记

1. 植物材料选择与预处理

材料类型：

幼嫩叶片（如拟南芥、烟草）、根尖、花粉管等薄而透明的组织，可直接撕取表皮或制作徒手切片；

较厚的组织（如茎秆、成熟叶片）需用切片机切成 50-100 μm 的薄片，或通过压片法（如根尖染色体观察）分散细胞。

预处理（可选）：

固定：若观察动态结构（如微管、细胞器运动），可用 4% 多聚甲醛固定 15-30 分钟，避免细胞结构破坏；

通透：需标记胞内蛋白时，用 0.1% Triton X-100 处理 5-10 分钟，增强染料进入细胞的效率。

2. 荧光染色与标记

根据观察目标选择染料：

观察对象常用荧光染料 / 标记方法激发 / 发射波长（参考）操作要点

细胞核 / DNADAPI（蓝色荧光）、Hoechst激发 358nm / 发射 461nm染色 5-10 分钟，需避光；可与 RNA 酶预处理减少非特异性结合。

细胞壁Calcofluor White（白色荧光）激发 350nm / 发射 440nm直接滴加染液染色 2-5 分钟，适用于纤维素和几丁质检测。

叶绿体自发荧光（红色）激发 430-480nm / 发射 650-700nm无需染色，直接观察；避免强光长时间照射导致荧光淬灭。

特定蛋白GFP/GFP 融合蛋白（绿色荧光）激发 488nm / 发射 507nm通过转基因或病毒载体导入植物细胞，需培养 24-48 小时后观察。

线粒体Mito-Tracker Red（红色荧光）激发 579nm / 发射 599nm工作浓度 100nM，37℃染色 15-20 分钟，需避光。

制片注意事项：

将染色后的样品置于载玻片中央，滴加少量蒸馏水或 PBS 缓冲液（避免细胞脱水），盖上盖玻片时从一侧缓慢放下，避免气泡产生；

若样品易移动，可在盖玻片四周用凡士林或指甲油封片，增强稳定性。

二、显微镜操作流程

1. 基础光路调节

放置与开机：将显微镜放置于稳定台面，远离光源直射和振动源，开启电源，预热光源（汞灯或 LED 光源需预热 5-10 分钟至亮度稳定）。

低倍镜找样：

安装 10× 低倍物镜，将样品装片置于载物台，用压片夹固定，使样品正对通光孔；

调节粗准焦螺旋下降镜筒（目视侧面避免物镜压片），再缓慢上升镜筒，直至视野中出现清晰的细胞轮廓（可通过调节聚光器高度和孔径光阑改善对比度，植物细胞因有细胞壁，可适当缩小光阑增强结构反差）。

2. 荧光观察参数设置

选择滤光片组：

根据荧光染料波长选择对应滤光片，例如：

DAPI/Calcofluor White：使用 UV（激发 330-385nm，发射 420nm 以上）滤光片组；

GFP：使用 BP470/40（激发 470nm）+ DM495（分束镜）+ BP525/50（发射 525nm）滤光片组；

叶绿体自发荧光 / Red 荧光染料：使用 BP545/30（激发 545nm）+ DM575 + BP605/70 滤光片组。

调节荧光强度：

初始观察时将光源强度调至 50%，避免强光损伤样品或产生背景噪声；

通过调节荧光光路中的光阑或中性密度滤镜（ND 滤镜）控制光强，兼顾信号亮度和抗淬灭性。

3. 高倍镜精细观察与对焦

切换物镜：在低倍镜下将目标细胞移至视野中央，转动物镜转换器至 40× 或 60× 高倍物镜（若观察亚细胞结构，可使用 100× 油镜，需在盖玻片上滴加一滴香柏油，使物镜与样品光学接触）；

微调焦与景深控制：

使用细准焦螺旋缓慢调节焦距，植物细胞因有大液泡，可能需要分层对焦（如聚焦于细胞核、叶绿体层）；

若细胞厚度较大导致荧光信号重叠，可通过显微镜配套的 Z 轴扫描功能（如有）进行多层拍摄，后期用软件叠加或三维重建。

三、关键注意事项

1. 样品与染色优化

自发荧光干扰：植物细胞中的叶绿素（红色荧光）、木质素（蓝色荧光）可能对观察产生背景干扰，可通过以下方式减少：

选择不含叶绿体的组织（如根尖、茎尖分生区）；

使用窄带滤光片或调节激发光波长，避开自发荧光峰值；

拍摄时降低荧光通道的增益或曝光时间。

染色特异性：

荧光染料需现配现用，DAPI、Calcofluor White 等需避光保存；

染色后用缓冲液充分洗涤，去除未结合的染料，减少背景荧光。

2. 显微镜操作技巧

避免光损伤：荧光观察时避免长时间照射样品（尤其是 GFP 等易淬灭的标记），可通过 “快速预览 - 定位 - 短时间拍摄" 的方式操作；

色差校正：高倍镜观察时，若出现彩色边缘，可通过调节物镜上的色差补偿环（若有）或使用复消色差物镜改善。

3. LV2000显微镜相机图像采集与分析

参数设置：成像软件中调整曝光时间（通常 50-500ms，根据荧光强度）、增益（避免过高导致噪点），勾选 “线性响应" 模式保证信号真实性；

多通道拍摄：若同时观察多种荧光（如 DAPI+GFP），需采用顺序扫描模式（避免通道串色），并保存为多通道 TIFF 格式以便后期分析。

四、常见问题与解决方案

问题可能原因解决方案

荧光信号弱染色浓度不足、激发光强度低增加染料浓度、延长染色时间；调大光源强度或更换新灯泡（汞灯寿命约 200 小时）

背景荧光强染料未洗净、自发荧光干扰增加洗涤次数；选择无自发荧光的组织或使用淬灭剂（如 DABCO）

图像模糊对焦不准、样品移动重新微调焦；用指甲油封片固定样品；检查载物台是否稳固

叶绿体自发荧光干扰激发光波长与叶绿素重叠更换长波激发滤光片（如观察 GFP 时用 488nm 激发，避开叶绿素 430nm 激发峰值）

通过以上步骤，可高效利用奥林巴斯 CX33 正置荧光显微镜观察植物细胞的亚细胞结构、蛋白定位或生理过程，结合荧光标记技术实现对植物细胞动态行为的精准分析。