奥林巴斯倒置CKX53显微镜观察细菌在网格计数板

奥林巴斯倒置CKX53显微镜结合网格计数板是观察和计数细菌的常用组合，其操作简便、成像清晰，适用于微生物学、环境科学及工业发酵等领域的细菌定量分析。以下从设备准备、样本处理、观察计数及注意事项四个方面进行系统性说明：

一、设备与材料准备

显微镜配置

奥林巴斯CKX53倒置显微镜：

光源：优先选用LED光源（如CKX-LED），提供稳定均匀的照明，减少热量对细菌活性的影响。

物镜：根据细菌大小选择10×、20×或40×物镜（NA≥0.25），确保视野清晰且覆盖网格区域。

目镜：10×目镜（视野直径约1.8-2.0mm）适合常规计数，若需更高精度可换用15×或20×目镜。

网格计数板：

类型：常用血细胞计数板（如Neubauer改进型）或专用细菌计数板（如Petroff-Hausser计数室）。

规格：

Neubauer计数板：中央区域分为25个中方格，每个中方格含16个小方格（边长0.2mm，面积0.04mm²），深度0.1mm（体积0.004mm³=0.000004mL）。

细菌专用计数板：网格更细（如0.02mm²/小方格），适合高密度样本。

辅助工具

盖玻片（厚度0.17mm）、载玻片（可选）、移液器（10μL量程）、无菌吸头、酒精棉球、记号笔。

二、样本处理与制片

样本稀释

目的：将细菌浓度调整至20-200个/中方格（Neubauer计数板）或50-150个/小方格（细菌专用板），避免过度密集或稀疏。

方法：

初步估算浓度：取10μL样本与990μL无菌水混合（1:100稀释），重复稀释至合适范围。

制片步骤

清洁计数板：用酒精棉球擦拭计数板和盖玻片，晾干后避免指纹污染。

盖玻片放置：将盖玻片轻压在计数室上，确保无气泡且边缘密封（防止样本溢出）。

加样：用移液器吸取10μL稀释后的样本，从计数室边缘缓慢注入，利用毛细作用使样本均匀填充计数室。

静置：等待2-3分钟使细菌沉降，避免移动计数板导致分布不均。

三、显微镜观察与计数

显微镜设置

对焦：切换至相差模式（若CKX53配备相差附件）或明场模式，调节粗/细准焦螺旋使网格线清晰可见。

光源调整：降低光源强度至适中（避免荧光干扰或细菌光损伤），关闭聚光镜虹彩光圈以减少眩光。

视野选择：优先计数中央区域（如Neubauer计数板的4个角及中央共5个中方格），减少边缘效应。

计数规则

边界处理：对压线细菌采用“数上不数下、数左不数右"原则（或统一计数上边和左边的细菌）。

死菌区分：若需区分活菌与死菌，可提前用台盼蓝染色（活菌拒染，死菌染蓝），或通过形态差异（如破碎细胞）判断。

重复计数：对同一样本重复计数2-3次，取平均值以提高准确性。

四、注意事项与优化技巧

避免误差来源

样本均匀性：稀释后充分混匀，避免细菌沉降导致浓度不均。

网格对齐：确保计数板网格与显微镜视野十字线平行，减少计数偏差。

时间控制：计数应在样本制备后30分钟内完成，防止细菌繁殖或死亡影响结果。

特殊场景处理

高密度样本：进一步稀释至可计数范围，或改用荧光染色结合自动计数软件（如ImageJ的Cell Counter插件）。

运动性细菌：在样本中加入少量甲醛（终浓度0.5%）固定细菌，或使用琼脂覆盖法限制运动。

链状/簇状细菌：记录链或簇的数量，按单个细菌计算（或根据研究需求调整规则）。

设备维护

清洁：使用后用压缩空气吹除计数板残留样本，避免腐蚀金属部件。

校准：定期检查显微镜光源强度、物镜分辨率及网格计数板精度（如通过标准微球验证）。

五、应用案例

发酵工业：监测乳酸菌发酵过程中的活菌数变化，优化发酵条件（如pH、温度）。

环境监测：计数水体中的大肠杆菌群落，评估水质污染程度。

临床诊断：快速检测尿液或血液中的病原菌浓度，指导抗生素用药剂量。

通过规范操作和细节优化，奥林巴斯CKX53显微镜结合网格计数板可实现细菌浓度的快速、准确测定，为微生物研究提供可靠数据支持。