培养箱活细胞增值过程时间序列荧光显微观察设备

培养箱活细胞增殖荧光观察是一种借助荧光标记技术和特定设备，在细胞培养过程中实时、动态地监测细胞增殖情况的方法。以下是详细介绍：

荧光标记方法

活细胞细胞核探针标记：可使用 Hoechst 33342，其激发波长为 350nm，发射波长为 461nm，低毒性，在 2-5μg/mL 浓度下可维持 48 小时，能清晰标记细胞核，便于计数分裂细胞。SiR-DNA 也是常用的探针，其具有远红外荧光，激发波长为 652nm，发射波长为 674nm，光毒性极低，适合 72 小时以上的长时间观察。

增殖特异性荧光蛋白标记：通过基因编辑技术，如将 Ki67 与 GFP 融合，构建 Ki67-GFP 融合蛋白，Ki67 仅在增殖细胞中表达，可据此区分增殖细胞和静息细胞，直接筛选出增殖细胞群体。

成像设备及参数设置

集成式培养箱荧光显微镜：如赛多利斯 Incucyte SX5，可直接嵌入培养箱内，支持 6 个独立板位，兼容 384 孔板，能同时监测细胞增殖、迁移、凋亡等 10 余种动态过程。它提供绿色（Ex：440-480nm，Em：504-544nm）、红色（Ex：565-605nm，Em：625-705nm）等多通道荧光成像，结合 HD 相差成像，无需取出细胞即可完成多维度分析。

小型化培养箱内荧光显微镜：以 CytoSMART Lux3 FL 为代表，体积小巧，可适配不同尺寸培养箱，支持 APP 远程监控，分辨率达 1μm，支持 3 通道荧光（蓝 / 绿 / 红），适合药物筛选和干细胞分化追踪等中小规模实验。

成像参数设置：以观察 HeLa 细胞增殖为例，激发光强度荧光通道一般≤20%，如 Hoechst 通道激发光强度可设置为 10%-15%；曝光时间荧光通道为 50-200ms，明场通道为 10-50ms；时间间隔可设置为 15-30 分钟 / 次，以完整捕捉细胞分裂过程；视野数量方面，96 孔板每孔可拍 3-5 个视野，覆盖不同细胞密度区域。

数据分析

图像预处理：常用工具包括 Incucyte Analysis Software、ImageJ（Fiji）等。通过背景扣除，如使用 Fiji 的 “滚动球背景扣除" 功能，去除培养皿背景荧光；运用 “高斯滤波" 消除随机噪音，避免误判为细胞；设置固定阈值进行阈值分割，将细胞核转化为黑白二值图像，便于自动计数。

增殖指标计算：通过计数不同时间点的细胞核数量，结合时间维度，可提取细胞总数增长曲线、增殖倍数等关键增殖指标，反映细胞增殖的动态规律。