相差 荧光活细胞显微时间序列动态观察采集设备

相差 - 荧光活细胞显微时间序列动态观察，是将相差显微镜技术与荧光显微镜技术结合，对活细胞进行长时间、周期性的动态成像记录，从而实时追踪细胞形态变化、亚细胞结构动态及分子表达 / 定位等过程的前沿显微成像方法。该技术既解决了活细胞无标记观察的需求，又实现了特异性分子靶向追踪，是细胞生物学、发育生物学、药理学等领域研究活细胞动态行为的核心手段。

一、核心技术原理：相差与荧光的 “互补协作"

该技术的核心是两种显微技术的协同 —— 相差技术负责 “无标记看形态"，荧光技术负责 “特异性看分子"，二者结合实现活细胞动态的 “全景 + 精准" 观察。

1. 相差显微镜技术：无标记观察活细胞形态

活细胞通常透明（折射率与周围培养基差异小），普通明场显微镜难以分辨细节。相差技术通过将细胞内部折射率差异转化为明暗对比，无需染色即可观察活细胞的形态、运动及内部结构（如细胞核、线粒体、细胞膜边缘），避免了染色对细胞活性的破坏。

关键原理：利用光的 “相位差"（光穿过细胞不同结构时，因折射率不同导致传播速度差异，产生相位差），通过显微镜内的 “相差板" 将不可见的相位差转化为可见的 “振幅差"（明暗差异），使透明细胞呈现清晰的明暗对比图像。

优势：无标记、不损伤细胞，可长期观察细胞存活状态；适合观察细胞贴壁、迁移、分裂等宏观动态行为。

2. 荧光显微镜技术：特异性追踪分子 / 亚细胞结构

荧光技术通过 “荧光探针"（如荧光染料、荧光蛋白）与细胞内特定靶点（如 DNA、蛋白质、细胞器膜）特异性结合，在激发光照射下探针发出荧光，从而实现对目标结构的精准定位和动态追踪。

关键原理：基于 “荧光现象"—— 荧光探针吸收特定波长的激发光后，电子跃迁到高能级，再回到基态时释放出波长更长的荧光；显微镜通过 “激发滤光片"（筛选激发光）、“ dichroic 镜"（反射激发光、透过荧光）和 “发射滤光片"（筛选荧光），仅采集目标荧光信号，排除背景干扰。

常用探针举例：

细胞核标记：DAPI（结合 DNA，发蓝色荧光）；

细胞骨架标记：Alexa Fluor 488 - 鬼笔环肽（结合肌动蛋白，发绿色荧光）；

分子表达追踪：GFP（绿色荧光蛋白，融合到目标蛋白上，实现动态定位）。

3. 时间序列成像：动态记录细胞行为

通过显微镜的自动控制模块（如电动载物台、自动聚焦、快门控制），按设定的时间间隔（如每 5 分钟、每 1 小时）对同一视野的细胞进行连续成像，生成 “时间序列图像栈" 或动态视频。结合图像分析软件（如 ImageJ、MetaMorph），可量化分析细胞迁移速度、分裂周期、荧光信号强度变化等参数。

二、核心应用场景：聚焦 “活细胞动态过程"

该技术因能兼顾 “无损伤" 与 “特异性"，广泛应用于需实时追踪细胞动态的研究领域：

应用领域具体研究方向技术价值

细胞生物学细胞分裂周期追踪、细胞迁移 / 侵袭、细胞凋亡动态无标记观察分裂形态，同时用荧光标记染色体（如 H2B-GFP），精准定位分裂阶段

发育生物学早期胚胎发育（如斑马鱼 / 线虫胚胎细胞分化）、干细胞分化动态长期记录胚胎细胞增殖分化过程，荧光标记分化标志物（如 Oct4、Sox2）

药理学药物对细胞的动态影响（如药物诱导的细胞骨架重组、凋亡过程）实时观察药物作用下细胞形态变化，同时用荧光探针检测凋亡信号（如 Annexin V）

分子生物学蛋白质定位与转运（如膜蛋白内吞、细胞器间物质交换）荧光标记目标蛋白，追踪其在细胞内的动态移动路径

病毒学病毒入侵宿主细胞的过程（如新冠病毒与细胞膜结合、病毒颗粒在细胞内扩散）荧光标记病毒颗粒（如 GFP 标记病毒衣壳蛋白），实时记录入侵步骤

三、关键技术挑战与解决方案

活细胞长时间成像需克服 “细胞存活" 与 “成像质量" 的矛盾，核心挑战及应对策略如下：

1. 细胞活性维持：避免成像过程损伤细胞

长时间成像（数小时至数天）中，光照、温度、CO₂浓度等均可能影响细胞存活，需通过 “环境控制模块" 解决：

温度控制：显微镜载物台配备加热板 / 加热套，维持 37℃（哺乳动物细胞）恒温，避免温度波动导致细胞代谢紊乱；

气体控制：内置 CO₂培养小室（通入 5% CO₂），维持培养基 pH 稳定（避免 pH 变化导致细胞凋亡）；

湿度控制：小室加装湿度模块，防止培养基蒸发导致渗透压升高；

光毒性抑制：

选择 “低光毒性荧光探针"（如 GFP 变体 mNeonGreen，比传统 GFP 更亮，可降低激发光强度）；

采用 “脉冲式激发"（缩短激发光照射时间，如每次照射 10-50ms），减少光对细胞的氧化损伤；

优先用相差成像记录形态，仅在关键时间点启动荧光成像。

2. 成像稳定性：避免长时间成像的 “漂移"

长时间成像中，载物台位移、焦距偏移（如培养基蒸发导致液面下降）会导致图像模糊，需通过 “自动校正模块" 解决：

自动聚焦（Auto-focus）：基于 “对比度检测" 或 “激光反射聚焦"，每次成像前自动调整物镜焦距，确保细胞始终处于焦平面；

自动载物台校正（Auto-stage correction）：通过图像中 “参考标记"（如培养皿边缘、固定的细胞结构），实时校正载物台的 X/Y 轴位移；

使用高稳定性载物台：采用无振动的电动载物台，避免环境振动（如实验室人员走动）对成像的影响。

3. 图像信噪比：排除背景干扰，清晰捕捉信号

活细胞成像中，背景荧光（如培养基自发荧光、细胞 autofluorescence）会影响信号质量，需通过 “光学优化 + 软件处理" 解决：

光学层面：

使用 “高数值孔径（NA）物镜"（如 NA 1.4 的油镜），提高荧光信号采集效率；

搭配 “共聚焦扫描模块"（可选升级），通过针孔排除焦外荧光，显著提升信噪比（适合厚样本或高背景场景）；

软件层面：

成像后用软件（如 ImageJ）进行 “背景扣除"“平滑滤波"，减少噪声干扰；

对时间序列图像进行 “配准"，校正微小位移导致的信号偏移。

四、典型实验流程示例（以 “细胞迁移追踪" 为例）

样本制备：将待观察细胞（如 HeLa 细胞）接种到 “玻璃底培养皿"（适配显微镜载物台，保证光学清晰度），加入含血清的培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱中贴壁生长至 50%-70% 融合度；

荧光标记（可选）：若需标记特定结构（如细胞骨架），加入荧光探针（如 Alexa Fluor 488 - 鬼笔环肽），37℃孵育 20 分钟，用 PBS 洗去未结合探针，加入新鲜培养基；

显微镜 setup：将培养皿放入显微镜的 “环境控制小室"，设定温度 37℃、CO₂浓度 5%，等待 10 分钟让细胞适应环境；

视野选择与参数设定：

在明场 / 相差模式下找到目标视野（选择细胞分布均匀、无明显杂质的区域）；

设定成像模式：同时采集 “相差图像"（记录细胞形态）和 “荧光图像"（记录细胞骨架）；

设定时间序列参数：成像间隔 10 分钟，总成像时间 12 小时（共 72 个时间点），每个视野拍摄 3 个 Z 轴层面（避免焦距漂移）；

启动成像：开启自动成像程序，期间避免触碰显微镜或实验台，防止振动；

数据分析：

用 ImageJ 导入时间序列图像栈，进行背景扣除、Z 轴投影（取最清晰层面）；

使用 “细胞追踪插件"（如 TrackMate）标记单个细胞，计算细胞迁移轨迹、迁移速度、方向角等参数；

结合荧光信号强度分析，观察细胞迁移过程中细胞骨架的动态变化（如丝状伪足的伸出与收缩）。

综上，相差 - 荧光活细胞显微时间序列动态观察技术，通过 “无标记 + 特异性标记" 的协同优势，为活细胞动态行为研究提供了高时空分辨率的可视化工具，其核心是在 “细胞存活" 与 “成像质量" 之间找到平衡，同时依赖精准的环境控制和后期数据分析，才能充分发挥其在生命科学研究中的价值。