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智能活细胞Hep G2培养箱内荧光动态观察分析实验

更新时间:2025-08-26      点击次数:40

活细胞 Hep G2 培养箱内荧光动态观察分析实验方案与关键技术解析


Hep G2 细胞(人肝癌细胞系)是肝脏代谢、药物毒性评估及肿瘤研究的经典模型,在培养箱内开展活细胞荧光动态观察,可实时捕捉细胞生理状态(如增殖、凋亡、代谢活性)、分子事件(如信号通路激活、蛋白定位)的动态变化,避免传统 “终点检测" 因细胞脱离培养环境导致的误差。以下从实验设计、关键操作、数据分析及常见问题解决四方面,系统梳理该实验的核心要点。


一、实验设计核心要素

1. 实验目的与荧光标记策略

需先明确动态观察的核心目标,再针对性选择荧光探针或标记方法,确保标记特异性、低毒性及与 Hep G2 细胞特性的匹配性。

2. 实验分组与对照设置

Hep G2 细胞实验需严格设置对照,排除荧光干扰、环境波动及探针本身的影响,常见分组如下:

空白对照:仅 Hep G2 细胞 + 培养基,无任何荧光标记,用于检测背景荧光(如培养基自发荧光、细胞 autofluorescence)。

阴性对照:Hep G2 细胞 + 荧光探针(无处理因素),用于确认探针特异性(如无目标分子时的荧光强度)。

阳性对照:Hep G2 细胞 + 已知作用的处理剂 + 荧光探针(如观察凋亡时用 10μM 顺铂处理,观察增殖时用 10% FBS 刺激),用于验证实验体系有效性。

实验组:Hep G2 细胞 + 待测试处理(如药物浓度梯度、缺氧条件、细胞因子)+ 荧光探针,根据实验目的设置 3-5 个生物学重复。

3. 时间序列与观察参数设定

根据观察目标确定时间间隔(Δt)和总观察时长(T),避免因间隔过长遗漏关键事件,或过短导致细胞应激(如反复光照):

短期观察(数小时至 1 天):如信号通路激活(如 NF-κB 核转位,响应时间 30min-6h),时间间隔设为 15-30min,总时长 6-12h。

中期观察(1-7 天):如细胞增殖、药物毒性(如 IC50 检测),时间间隔设为 2-4h,总时长 3-7 天(需注意培养基更换,避免营养耗尽)。

长期观察(7-14 天):如细胞分化、肿瘤球形成,时间间隔设为 6-12h,总时长 7-14 天(需使用抗蒸发培养皿,定期补充培养基)。

同时固定荧光激发光强度(Ex)、发射光滤光片(Em)、曝光时间(通常 100-500ms),避免因光强过高导致光毒性(如活性氧产生、细胞凋亡)或荧光淬灭。

二、实验关键操作步骤

1. 前期准备:细胞预处理与荧光标记

Hep G2 细胞复苏与传代:

从液氮中复苏 Hep G2 细胞,用含 10% 胎牛血清(FBS)、1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 高糖培养基培养,置于 37℃、5% CO₂培养箱中,待细胞融合度达 70%-80% 时传代(传代比例 1:3),确保实验用细胞处于对数生长期(活力 > 95%,台盼蓝染色检测)。

细胞接种与贴壁:

选择适配活细胞成像的培养皿 / 板(如玻璃底培养皿、96 孔玻璃底微孔板),用 PBS 清洗 2 次后,将 Hep G2 细胞以 1×10⁴-5×10⁴ cells/cm² 的密度接种(确保观察时细胞不重叠,便于单个细胞追踪),置于培养箱中孵育 24h,待细胞贴壁。

荧光标记(非病毒转染类):

按探针说明书配制工作液(如 CFSE 用 DMSO 溶解后,用培养基稀释至终浓度 5μM),吸弃旧培养基,加入荧光探针工作液,37℃孵育 15-30min(具体时间参考探针说明)。

孵育后用预热的 PBS 清洗细胞 2-3 次,去除未结合的游离探针,加入新鲜预热的培养基,避免探针残留导致的背景荧光干扰。

2. 成像系统搭建与环境控制

核心设备:活细胞成像培养箱(如 Olympus CellVivo、Zeiss Incubator XL),需具备以下功能:

精准控温(37±0.5℃):避免温度波动导致 Hep G2 细胞代谢紊乱(如低温抑制增殖,高温诱导凋亡)。

CO₂浓度控制(5±0.1%):维持培养基 pH 稳定(DMEM 培养基含 NaHCO₃,需 CO₂平衡 pH 至 7.2-7.4)。

湿度控制(>95%):防止培养基蒸发导致渗透压升高,可使用抗蒸发盖或添加无菌水至培养箱托盘。

成像模块:配备荧光显微镜(如 confocal 共聚焦显微镜,减少杂散光;或宽场显微镜,提高成像速度)、高灵敏度相机(如 sCMOS 相机,捕捉弱荧光信号)及自动载物台(实现多视野同时观察)。

3. 动态观察与数据采集

预观察与焦点校准:

实验开始前,在明场下确认 Hep G2 细胞状态(无漂浮、形态正常),选择 3-5 个代表性视野(避免边缘区域,细胞分布均匀),用荧光通道预览荧光信号强度,调整焦距至细胞清晰(建议使用 “Z-stack" 功能,选择细胞中层平面,避免聚焦在培养基表面或培养皿底部)。

启动时间序列采集:

在成像软件(如 Olympus CellSens、Zeiss ZEN)中设置参数:时间间隔、总时长、荧光通道顺序(建议先采集弱荧光通道,再采集强荧光通道,避免串色)、每个视野的图像数量(如每个视野采集 5-10 层 Z-stack,用于后续 3D 重构)。

采集过程中避免打开培养箱门,如需更换培养基(长期观察),需在超净台内快速操作(<5min),并提前将新培养基预热至 37℃,避免温度冲击。

数据存储:

选择无损格式存储图像(如 TIFF、CZI 格式),记录每个样本的元数据(如处理条件、荧光探针浓度、成像参数),避免因数据格式压缩导致信息丢失。

三、数据分析流程与指标解读

数据预处理:排除干扰与图像优化

背景扣除:使用软件自带工具(如 ImageJ 的 “Subtract Background" 功能),减去空白对照的背景荧光,降低培养基自发荧光、探针残留的影响。

图像对齐:长期观察中可能因培养箱震动导致视野偏移,用 “Image Registration" 工具(如 ImageJ 的 StackReg 插件)对齐时间序列图像,确保同一细胞可被追踪。

荧光淬灭校正:若观察时长超过 24h,荧光信号可能因光漂白下降,可通过阳性对照的荧光强度变化建立校正曲线,对实验组信号进行归一化(如将各时间点荧光强度除以初始时间点强度,得到相对荧光强度)。


通过以上实验设计与操作,可实现 Hep G2 细胞在生理培养条件下的荧光动态观察,精准捕捉细胞增殖、凋亡、分子事件的实时变化,为肝脏疾病机制研究、药物筛选提供高时空分辨率的数据支持。



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