奥林巴斯CX33显微镜明场荧光观察叶片气孔

使用奥林巴斯 CX33 显微镜通过明场和荧光观察叶片气孔，具体步骤如下：

奥林巴斯 CX33 显微镜样品准备

叶片采集：选取健康、具有代表性的植物叶片。尽量在植物生长旺盛期采集，以保证气孔处于正常生理状态。

叶片处理：将采集的叶片用清水冲洗干净，去除表面的灰尘和杂质。对于一些较厚或有蜡质层的叶片，可以用刀片轻轻刮去表面的蜡质，以便后续染色剂和荧光染料更好地渗透。

染色与荧光标记

明场观察染色：对于明场观察，可使用亚甲基蓝等染料对叶片进行染色。将叶片浸泡在 0.1% - 0.5% 的亚甲基蓝溶液中 5 - 10 分钟，然后用清水冲洗，去除多余的染料。亚甲基蓝可以使气孔周围的细胞结构着色，便于在明场下观察气孔的形态和分布。

荧光观察标记：选择合适的荧光染料标记叶片气孔。例如，用碘化丙啶（PI）对叶片进行染色，它可以标记细胞的细胞壁和细胞核等结构，使气孔在荧光下更易观察。将叶片浸泡在含有适量 PI（如 5 - 10 μg/mL）的溶液中 15 - 20 分钟，然后用缓冲液冲洗干净。PI 在蓝光激发下会发出红色荧光，能清晰地显示出细胞轮廓，从而突出气孔结构。

奥林巴斯 CX33 显微镜显微镜设置

明场设置

调整光源：打开奥林巴斯 CX33 显微镜的光源，通过调节亮度旋钮将光源强度调整到合适的水平。一般来说，对于观察叶片气孔，中等强度的光源即可，过强的光源可能会导致图像过亮，影响对比度，而过弱的光源则会使图像较暗，细节难以看清。

选择物镜和目镜：根据叶片的大小和观察的详细程度要求，选择合适的物镜和目镜组合。通常，10 倍或 20 倍的物镜可用于整体观察叶片气孔的分布情况，40 倍或更高倍数的物镜则用于观察气孔的细微结构。目镜一般选择 10 倍的即可满足大多数观察需求。

调节聚光器：通过上下移动聚光器，使光线聚焦在样品上，以获得最佳的照明效果和图像对比度。聚光器的高度和孔径光阑的大小会影响光线的汇聚程度和样品的照明均匀性，需要根据实际观察情况进行微调。

荧光设置

选择滤光片组：根据所使用的荧光染料的激发和发射波长，选择相应的荧光滤光片组。如使用 PI 染色，需要选择能够激发 PI 荧光（通常为蓝光激发）且能过滤掉其他波长光线的滤光片组，以确保只有 PI 发出的红色荧光能够被观察到，避免其他杂散光的干扰。

设置激发光强度和曝光时间：荧光观察时，要根据荧光信号的强弱适当调整激发光强度和曝光时间。开始时，可将激发光强度设置为较低水平，曝光时间设置为较短值，然后根据观察到的荧光图像的亮度和清晰度，逐渐调整这两个参数，以获得最佳的荧光图像效果。但要注意避免激发光强度过高和曝光时间过长，以免引起荧光淬灭和样品损伤。

观察与记录

奥林巴斯 CX33 显微镜明场观察

放置样品：将处理好的叶片样品放在显微镜载物台上，用载玻片和盖玻片固定好，确保叶片平整，避免产生褶皱或气泡影响观察。

对焦与观察：通过粗调焦旋钮将物镜靠近样品，然后缓慢调节微调焦旋钮，使叶片图像清晰对焦。首先在低倍物镜下找到叶片的边缘或叶脉等标志性结构，然后移动载物台，找到含有气孔的区域。观察气孔的形态、大小、分布密度以及周围细胞的结构特征。注意观察气孔是开放状态还是关闭状态，记录不同部位气孔的特点。

LV2000显微镜相机图像记录：如果显微镜配备了成像系统，可以拍摄明场下叶片气孔的图像。拍摄时，要确保图像清晰、对比度良好，能够准确反映气孔的形态和分布情况。可以拍摄多张不同视野的图像，以便后续分析和比较。

荧光观察

切换到荧光模式：在明场观察完成后，关闭明场光源，切换到荧光照明模式。确保荧光滤光片组已正确插入光路中。

重新对焦与观察：由于荧光图像的焦点可能与明场略有不同，需要再次微调焦旋钮，使荧光图像清晰对焦。观察叶片气孔在荧光下的形态和分布。注意荧光信号的强度、分布范围以及与周围细胞结构的关系。例如，PI 染色后，气孔周围的细胞壁会发出红色荧光，形成清晰的轮廓，可更准确地观察气孔的边界和形状。

图像记录与分析：使用成像系统拍摄荧光图像，记录气孔在荧光下的特征。可以对荧光图像进行进一步的分析，如测量气孔的面积、周长等参数，或者分析荧光强度的分布情况，以获取更多关于气孔结构和功能的信息。

在观察过程中，要保持实验环境的稳定，避免震动和温度变化对显微镜成像的影响。同时，为了获得更准确和全面的结果，可以对多个不同品种、不同生长条件下的叶片进行观察和比较，分析叶片气孔在不同情况下的差异和特点。